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Scientific Reports volume 12, Número do artigo: 9930 (2022) Citar este artigo

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A microscopia eletrônica criogênica tornou-se uma ferramenta poderosa para estudar objetos biológicos. Para objetos não biológicos (soluções, géis, dispersões, argilas), a polêmica sobre a interpretação dos resultados da microscopia criogênica ainda está em andamento, dividindo-se em duas tendências contraditórias: considerar a estrutura como um estado quase real da amostra ou como artefatos de congelamento. Neste estudo, uma microestrutura de uma gama de soluções aquosas estáveis ​​e dispersões (ágar, caulim, montmorilonita, nanopartículas) foi investigada por meio de crio-SEM e confocal LSM para comparar estruturas criofixadas e descongeladas. A correlação observada entre esses dois métodos para os sistemas estudados (ágar, caulim, montmorilonita, NPs) permitiu afirmar que a microestrutura ordenada é uma característica inerente a esses sistemas. Algumas inconsistências nas dimensões da microestrutura foram discutidas e prescritas para as diferenças nas camadas bulk e interface. Supostamente, as soluções de NaCl também possuem microestrutura dinâmica (nível de femtosegundo) de aglomerados de água pura e Na+ e Cl- solvatados que podem ter um impacto nas propriedades anormais do eletrólito.

Desde a descoberta da microscopia eletrônica criogênica (cryo-EM) há mais de trinta anos, muitos dados foram acumulados neste campo1,2. Esta técnica de imagem permite observar espécimes em micro e nanoescala em seu ambiente aquoso nativo, sem secagem que causa deformação irreversível da estrutura. A observação torna-se possível devido à solidificação da água por agentes criogênicos, ou seja, criofixação. Este último é um passo crítico nesta técnica: o congelamento ultrarrápido impede o crescimento de cristais de gelo, mantendo intactas as estruturas originais. A criofixação geralmente é obtida mergulhando uma amostra em crioagente (lama de nitrogênio, propano, etano, etc.), que é seguida por fratura (para observar a estrutura interna da amostra) e sublimação (ou seja, gravação em gelo) que permite observe a estrutura sem camada de água. Hoje, a técnica cryo-EM tornou-se uma ferramenta poderosa para estudar objetos biológicos. Uma discussão duradoura sobre a congruência entre sua microestrutura em estados criofixos e não congelados foi concluída pelo consenso de que os resultados de crio-EM refletem o estado quase real de espécimes biológicos em parte de seus elementos estruturais mais densos (esqueleto, membrana, etc. )1,2. O consenso foi baseado nos dados acumulados mostrando correlação entre diferentes técnicas de imagem. Quanto aos componentes biológicos líquidos e gelatinosos (muco, líquidos inter e extracelulares, etc.), permanecem as dúvidas que podem ser atribuídas às dificuldades de visualização de estruturas de baixa densidade (baixo contraste, mobilidade, etc.) . Uma das formas de resolver este problema é desenvolver técnicas que permitam observar amostras úmidas em condições próximas às nativas em alta resolução. Nessa direção, foi relatado o desenvolvimento do novo SEM atmosférico (ASEM), que é uma combinação de um microscópio eletrônico de varredura invertido (com uma placa destacável de cultura aberta) e um microscópio de fluorescência3. O ASEM permite observar quase simultaneamente a mesma área do topo e do fundo da amostra em solução aquosa (encapsulada em filme de SiN permeável a elétrons) à pressão atmosférica. Usando esta técnica, conexões neuronais, osteoblastos, retículo endoplasmático, tecidos ósseos, endocitose celular e mitose foram visualizados3,4.

Em comparação com objetos biológicos, sistemas aquosos não biológicos (por exemplo, soluções, dispersões, géis, argilas) não possuem limites de fase distintos (densos) na água, e a interpretação de seus resultados de crio-EM ainda é ambígua e dividida em duas tendências contraditórias. De acordo com uma tendência, a microestrutura observada em amostras criofixadas é interpretada como resultado da formação de cristais aquosos - como artefato de congelamento5,6,7,8,9,10,11. Este último aparece quando substâncias dissolvidas/dispersas se difundem em direção à periferia do cristal de gelo, levando à formação da estrutura7. Dentro de outra tendência, a microestrutura de amostras criofixadas é considerada quase real. Este ponto de vista é frequentemente apoiado por correlação com imagens de microscopia óptica ou confocal de varredura a laser (LSM), como foi mostrado, por exemplo, para fluidos de fraturamento espumados, emulsões formadas com pectina de origem de maçã, dispersões de nanopartículas, argilas minerais8,11,12, 13,14,15. Diferenças notadas na dimensão da microestrutura (se comparar resultados de LSM e crio-EM) não foram interpretadas e, portanto, confusas8. As opiniões contraditórias da microestrutura criofixada indicam uma inconsistência dos resultados experimentais com o conceito geralmente aceito para soluções e colóides como moléculas/íons/partículas homogeneamente distribuídas em solvente16. Assim, a polêmica sobre a interpretação das observações de microscopia criogênica de amostras não biológicas ainda está em andamento, e mais pesquisas são necessárias para esclarecer esse problema.